HPFA를 이용한 HSA와 ibuprofen 이성질체의 단백질 결합력의 측정

초록

인체 내에서 약리성분은 Human Serum Albumin (HSA)과 같은 혈장 단백질과 약리성분의 평형 관계에 의하여 결합되어 있는 약리성분 (bound drug)과 혈장단백질과 결합되지 않은 약리성분 (unbound drug)으로 이루어져 있다. 혈장 단백질과 결합되지 않은 약리성분 (unbound drug)은 분자 크기가 작기 때문에 쉽게 상처 부위로 도달하여 치료 효과가 높지만, 혈장 단백질과 결합된 약리성분 (bound drug)은 분자 크기가 크기 때문에 혈관벽을 통과하기 어렵고, 약리성분이 상처 부위로 이동하기가 쉽지 않아서 치료 효과가 줄어들게 된다. 약리성분의 전달현상을 규명하기 위해서는 혈장 단백질과 약리성분의 결합력에 대한 연구가 선행되어야 한다. 본 실험에서 혈장 단백질인 HSA는 Fluka Co.에서 구입하였고, 약리성분인 s-ibuprofen은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 컬럼은 일본의 Nomura사의 diol-silica column (Develosil 100Diol5, 100 x 4.6 mm I.D.)을 미국의 Phenomenex Co.로부터 구입하였다. 이동상은 인산완충용액을 사용하였고, 이동상의 pH와 I (이온세기)를 조절하기 위하여 sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4?2HO2, Sigma-Aldrich Co.)와 sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4?7HO2, Sigma- Aldrich Co.)를 첨가하였다. HPLC에 컬럼 오븐(CTS30 HPLC column oven, 영린기기)을 장착하여 일정한 온도로 유지하였고, 펌프(M930 solvent delivery pump, 영린기기)와 486 검지기 (M 720 Absorbance detector, 영인과학)를 사용하였다. S-ibuprofen 300 μM과 HSA 350 μM을 제조하여 37 ℃에서 3시간 동안 반응을 시킨 후 on-line HPFA 컬럼에 주입하였다. 컬럼 내부에 HSA과 결합되지 않은 약리성분의 영역이 발생하게 된다. 이 약리성분의 영역은 평평한 영역으로 사다리꼴 형태로서 용출되고, 평평한 영역에서 약리성분의 농도는 초기의 시료 용액의 HSA 결합되지 않은 약리성분의 농도와 같게 된다. 5 ㎕부터 주입 부피를 증가시켜서, 300 μM의 s-ibuprofen, 350 μM HSA의 경우, 70 ㎕에서 평평한 사다리꼴 영역이 나타나는 것을 실험적으로 확인하였다.